Разработка методики мультиплексного анализа колицинотипов E. coli

Аннотация

Внутривидовые антагонистические взаимоотношения E. coli, путем продукции бактериоцинов – колицинов, являются ключевым фактором, определяющим динамику микробиальных сообществ. Предположительно, риски возникновения коли-инфекции могут зависеть от разнообразия колицинотипов E. coli в организме животного. Большое количество штаммов E. coli в составе кишечного микробиоценоза не может быть изучено методами традиционной микробиологии. Целью исследования была разработка методики анализа разнообразия колицинотипов E. coli методом высокопроизводительного секвенирования. С использованием биоинформационного анализа была проведена кластеризация генов колицинов, выявлены консервативные участки генов колицинов, формирующих кластеры. Дизайн праймеров для ПЦР и высокопроизводительного секвенирования проводили с использованием ПО NGS-PrimerPlex. На основе выявленных нуклеотидных последовательностей была разработана система из 17 пар праймеров, обеспечивающая проведение мультиплексных ПЦР реакций на наличие широкого спектра генов колицинов, маркеров вирулентности FliC, PapF, FimH и высокополиморфного локуса генома GND, обеспечивающая эффективный анализ биоразнообразия E. coli, c использованием технологий высокопроизводительного секвенирования. Предложенная система праймеров была аппробирована для мультилокусного секвенирования отдельных штаммов E. coli. Для аппробации методики изоляты кишечной палочки выделены из сердца, паренхиматозных органов от птиц и свиней (11 изолятов). Часть из 11 штаммов E. coli, выделенных от с.-х. птицы и свиней, были успешно идентифицированы по повышенной представленности генов соответствующих колицинов. Всего были выявлены колицины M, Ib, B, V и 2 аллельных варианта GND. Данный методический подход обеспечивает возможности изучения микробиоценозов E. coli, включая их биоразнообразие, эпизоотическую значимость генотипов и кооперативный антагонизм.